Viroidforschung/Wechselwirkung zwischen Viroiden und RNAi
Wie Virusinfektionen so lösen auch Viroidinfektionen in der Wirtspflanze einen als "RNA interference" (RNAi) bezeichneten Abwehrmechanismus aus [RNA interference (RNAi)]. Um diesen Abwehrmechanismus zu blockieren, kodieren fast alle Pflanzenviren für so genannte „silencing suppressor“ Proteine (Virale RNAi Suppressoren). Diese Proteine verhindern, dass die viralen RNAs vorzeitig degradiert werden und gewährleistet die erfolgreiche Vermehrung des jeweiligen Virus. Viroide kodieren nicht für Proteine und können somit auch nicht auf eine proteinbasierende „silencing suppressor“ Strategie zurückreifen. Dennoch können sie sich replizieren und in der Pflanze systemisch ausbreiten. Die Vermutung liegt daher nahe, dass die Viroid RNA selbst eine „silencing suppressor“ Aktivität besitzt. Diese Annahme wird durch die Beobachtung gestützt, dass die durch Viroide induzierten Symptome (Abb. 1) häufig den durch Virusinfektion verursachten Symptomen ähneln. Man weiß heute, dass das RNAi nicht nur der Abwehr von Viren dient, vielmehr werden einige Pflanzengene durch den RNA-vermittelten „gene silencing“ Mechanismus reguliert. Werden bestimmte Prozesse des RNAi gestört, so zeigen die entsprechenden Pflanzen in der Regel starke Entwicklungsstörungen. Das Erscheinungsbild solcher Pflanzen ähnelt wiederum dem Phänotyp virusinfizierter Pflanzen.
Wir wollen nun ein Projekt durchführen, das Aufschluss über eine mögliche „silencing suppressor“ Aktivität der Viroide geben könnte. Komponenten des RNAi [RNA-dirigierte RNA Polymerasen (RDRs), „Dicer-like“ Proteine (DCLs) und „Argonaute“ Proteine (AGO)] sollen mittels Immunoprezipitation aus viroidinfizierten Pflanzen isoliert werden, um zu prüfen, ob eines diese Proteine direkt mit der Viroid-RNA assoziiert. Darüber hinaus wollen wir untersuchen, ob das systemische „silencing“ durch Viroide gestört wird. Wird das „silencing“ eines Transgens lokal induziert, so breitet sich dieser Vorgang mit einer zeitlichen Verzögerung in der Pflanze aus, d.h. das entsprechende Transgen ist nach einiger Zeit in der gesamten Pflanze „ausgeschaltet“. Dieses systemische „silencing“ kann in transgenen Pflanzen durch die Einführung so genannter „silencer“ Konstrukte (Viroidresistenz) ausgelöst werden. Im speziellen Fall sollen hier das systemische „silencing“ durch Agroinfiltration mit „silencer“ Konstrukten in PSTVd-infizierten, „green fluorescent protein-“ exprimierenden N. benthamiana Pflanzen induziert werden.
Abb. 1: Phänotyp einer PSTVd-infizierten Tomatenpflanze der Sorte
Money Maker (links infiziert, rechts PSTVd-frei)
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